Конструирование репортерных гриппозных онколитических векторов и оценка их безопасности при интракраниальном введении у крыс Translated title: Construction of oncolytic reporter influenza viral vectors and assessment of their safety following intracranial administration in rats

Abstract

ВВЕДЕНИЕ: Онколитические вирусы представляют собой перспективный инструмент для лечения злокачественных опухолей головного мозга в составе комплексной терапии.

ЦЕЛЬ ИССЛЕДОВАНИЯ: Разработка репортерных рекомбинантных вирусов гриппа А, экспрессирующих люциферазу NanoLuc, и оценка их безопасности при интракраниальном введении у крыс.

МЕТОДЫ: Репортерные штаммы вируса гриппа А, обладающие хемилюминесцентной активностью, были получены методом обратной генетики. Генетический сегмент NS штаммов Т_NS124-Luc и Е_NS124-Luc кодировал слитую белковую последовательность NS1₁₂₄ вируса гриппа и NanoLuc. В штаммах Т_NS124-2А-Luc и Е_NS124-2А-Luc белок-кодирующие последовательности были разделены 2А сайтом, обеспечивающим ко-трансляционное разделение белков. Для повышения специфичности вирусов к опухолевым клеткам в двух конструкциях (Е_NS124-Luc и Е_NS124-2А-Luc) в сайт протеолитического расщепления гемагглютинина были внесены точечные мутации S342→P и R343→I, приводящие к замене сайта протеолитического расщепления с трипсинового (T) на эластазный (E).

РЕЗУЛЬТАТЫ: Все исследованные конструкции имели сопоставимую репродуктивную и люминесцентную активность при культивировании в клетках MDCK. Однако при инфицировании клеточных линий глиом (С6, A172 и T98G) векторы с 2А сайтом перед трансгеном продемонстрировали более высокий потенциал роста. Интракраниальное введение высокой дозы вируса крысам было безопасным и не вызывало неврологических и других патологических симптомов. При этом люминесцентный репортер NanoLuc экспрессировался в месте введения, без формирования инфекционного вирусного потомства.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ: Показана возможность экспрессии трансгена в зоне интракраниального введения репортерного штамма вируса гриппа А, обладающего хемилюминесцентной активностью, в отсутствии активной вирусной репликации.

Translated abstract

INTRODUCTION: Oncolytic viruses are a promising treatment approach for treating malignant brain tumors as part of combination therapy.

OBJECTIVE: To develop reporter influenza A viruses expressing NanoLuc luciferase and evaluate their safety following intracranial administration in rats.

METHODS: Chemiluminescent reporter influenza A virus strains were obtained by reverse genetics. The NS genetic segment of the T_NS124-Luc and E_NS124-Luc strains encoded a fusion protein combining NS1₁₂₄ and NanoLuc. In the T_NS124-2A-Luc and E_NS124-2A-Luc strains, the NS1₁₂₄ and NanoLuc sequences were separated by a 2A co-translational cleavage site. To enhance the tumor specificity of the viruses, the trypsin cleavage site (T) in the HA protein was replaced with an elastase cleavage site (E) by introducing S342→P and R343→I substitutions in the HA region of the E_NS124-Luc and E_NS124-2A-Luc constructs.

RESULTS: The constructs demonstrated comparable reproductive and luminescent activity in MDCK cells. However, vectors containing the 2A site upstream of the transgene infected the glioma cell lines C6, A172, and T98G more effectively. Intracranial administration of a high dose of the virus was safe, causing no neurological or other pathological symptoms in rats. In addition, the luminescent reporter NanoLuc was expressed at the injection site without the formation of active viral progeny.

CONCLUSION: This study demonstrated that a chemiluminescent influenza A virus strain can induce transgene expression at the site of intracranial injection without active viral replication.

Main article text

ВВЕДЕНИЕ

Глиобластома является наиболее распространенной первичной злокачественной опухолью головного мозга и характеризуется быстрыми темпами роста первичного узла опухоли, высокой инвазивностью, склонностью к метастазированию и рецидивам заболевания [1, 2]. Несмотря на повсеместное внедрение стандарта тройной терапии злокачественных глиом у взрослых, включающей резекцию опухоли с проведением химио- и радиотерапии, 50%-выживаемость пациентов остается на крайне низком уровне и составляет около 15 месяцев. Проблема заключается в возобновлении опухолевого роста в зоне первичного очага из-за невозможности тотального удаления опухолевых клеток при хирургической операции и резистентности части клеток к радио- и химиотерапии [3].

Перспективным подходом к лечению злокачественных глиом является онколитическая вирусная терапия, направленная на прямой лизис опухолевых клеток, модификацию микроокружения опухоли, ингибирование туморогенной васкуляризации и активацию специфического Т-клеточного иммунитета к опухолевым антигенам [4, 5].

Онколитический вирус может вводиться непосредственно в опухоль при ангиографии до радикальной операции и/или действовать в синергизме с проводимой химио- и радиотерапией, разрушая резистентные к терапевтическому воздействию опухолевые клетки и воздействуя на микроокружение опухоли.

Проводится большое количество исследований, направленных на повышение эффективности лечения злокачественных глиом с применением различных онколитических вирусов, обладающих естественной или индуцированной онколитической активностью и избирательным тропизмом к клеткам опухоли [4-6]. Для повышения эффективности лечения разрабатываются различные стратегии, при которых вирус может выступать в качестве вектора, экспрессирующего иммуноактивные молекулы (хемокины, цитокины, наноантитела к PD1-L1 и другие), которые воздействуют на опухолевое микроокружение и/или потенцируют онколитическое действие вируса [7, 8].

Онколитические свойства модифицированного вируса гриппа были продемонстрированы в ряде доклинических исследований [9-14]. Общими выводами этих работ, включая наш собственный опыт, являются: (i) прямая зависимость эффективности онколитической терапии от вводимой дозы вируса (вирусные концентраты с наличием 10¹⁰/мл вирусных частиц обладают максимальной активностью); (ii) безопасность введения онколитического вируса в высоких титрах непосредственно в ткань опухоли; (iii) повышенная онколитическая активность вирусов гриппа с модифицированным геном ns1, за счет усиленной стимуляции системы врожденного иммунитета в зоне аппликации вируса, (iv) высокая генетическая пластичность РНК-сегментированного генома вируса гриппа, что позволяет селекционировать штамм, адаптированный к конкретному типу опухоли.

Дополнительное преимущество, с точки зрения селективности воздействия и эффективности проникновения вирусной частицы в клетку хозяина, могут иметь эластазо-зависимые вирусы гриппа, которые получают путем направленного мутагенеза или селекции [15]. Так как ряд опухолей человека, включая глиобластомы, обладают повышенной эластазной активностью за счет нейтрофильной инфильтрации, эластазо-зависимый вирус гриппа имеет потенциал многоцикловой репродукции в опухолевом очаге, но не в здоровых тканях, где ферментативная активность эластазы в норме отсутствует.

В настоящем исследовании нами получены генетически стабильные трипсин-зависимые и эластазо-зависимые репортерные гриппозные векторы, обладающие высокой инфекционной и репортерной активностью, а также способностью инфицировать глиальные клетки. В экспериментах in vivo на крысах показано, что интракраниальное введение вируса в высокой дозе является безопасным для животных и сопровождается накоплением люциферазы в месте введения без формирования инфекционного вирусного потомства.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Плазмиды

Плазмида pHW-PR8-NS124-2A-Luc была получена на основе ранее сконструированной плазмиды pHW-PR8-NS124-Luc [16, 17], в которой белок-кодирующие последовательности (NS1₁₂₄ и NanoLuc) были разделены P2A-пептидом (ATNFSLLKQAGDVEENPGP) Porcine Teschovirus 1 [18], обеспечивающим «проскок» рибосомы (Евроген, Россия). Плазмида, кодирующая гемагглютинин вируса гриппа A/Puerto Rico/8/1934 (H1N1) (A/PR/8/34) с мутациями S342P, R343I [15], была получена путем сайт-направленного мутагенеза (Евроген, Россия). Плазмиды, кодирующие внутренние и поверхностные белки вируса гриппа A/PR/8/34 были получены из коллекции Лаборатории векторных вакцин ФГБУ «НИИ гриппа им. А. А. Смородинцева» Минздрава России.

Клеточные культуры

Клетки Vero (ATCC #CCL-81, США) культивировали в среде OptiPro (Gibco, США) с добавлением 2% GlutaMax (Gibco, США). Клетки MDCK (#FR-58; IRR, США), А172, T98G и Т2 (ФГБУ «Российский научный центр радиологии и хирургических технологий им. акад. А. М. Гранова», Россия) растили в среде АльфаМЕМ (Биолот, Россия) с добавлением 10% эмбриональной сыворотки (Биолот, Россия). Клетки глиомы крысы С6 (ФГБУ «НИИ гриппа им. А. А. Смородинцева») культивировали в среде DMEM (Биолот, Россия) c добавлением 20% сыворотки SC-biol, 1% GlutaMax и 1% пирувата натрия (Gibco, США).

Получение вирусов

Рекомбинантный вирус гриппа A/PR8-NS124-Luc (T_NS124-Luc) был получен ранее [16, 17]. Для сборки рекомбинантных вирусных векторов T_NS124-2A-Luc, E_NS124-Luc и E_NS124-2А-Luc клетки Vero трансфицировали набором из 8-ми двунаправленных плазмид [19] с использованием нуклеофектора Nucleofector II (Amaxa) и набора реагентов Nucleofection Kit V (Lonza #VCA-1003, Швейцария). Трипсин-зависимые штаммы T_NS124-Luc и T_NS124-2A-Luc накапливали в 10-12-дневных развивающихся куриных эмбрионах (РКЭ) (Синявинская птицефабрика, Россия), эластазо-зависимые штаммы E_NS124-Luc и E_NS124-2A-Luc – в клетках MDCK в присутствии 0.5 мкг/мл эластазы (Promega, США).

Определение инфекционной активности

Инфекционную активность вирусов определяли методом предельных разведений в культурах клеток MDCK, Vero и в системе РКЭ. Разведение вирусов для заражения клеток MDCK и Vero осуществляли в среде АльфаМЕМ или OptiPro с добавлением антибиотика-антимикотика (Gibco, США) и протеазы (1 мкг/мл ТРСК-трипсина или 0.5 мкг/мл эластазы). Для заражения РКЭ вирусы разводили в буфере DPBS (Биолот, Россия) с добавлением антибиотика-антимикотика. Для расчета 50% инфекционной дозы был использован метод Рида и Менча [20].

Постановка ОТ-ПЦР

Вирусную РНК выделяли набором реагентов RNeasy Mini Kit (Qiagen, Нидерланды). Генетический материал амплифицировали набором реагентов БиоМастер ОТ-ПЦР–Экстра (Биолабмикс, Россия) и специфичных праймеров к сегменту NS [21]. ОТ-ПЦР с детекцией в режиме реального времени проводили с использованием набора реагентов БиоМастер ОТ-ПЦР-Экстра (2х) (Биолабмикс, Россия), праймеров InfA-F, InfA-R и олигонуклеотидного зонда InfA-P.

Измерение люциферазной активности

Измерение ферментативной активности люциферазы проводили с использованием набора реагентов Nano-Glo Luciferase Assay System (Promega, США), планшетов с темными стенками (Thermo Fisher Scientific, США) и мультифотометра CLARIOstar (BMG LABTECH, Германия). Оценку хемилюминесценции in vivo проводили на приборе IVIS SpectrumCT In Vivo Imaging System (PerkinElmer, США).

Электрофоретическое разделение белков и Вестерн-блот анализ

Клетки MDCK, зараженные рекомбинантными штаммами в дозе 1 ТИД₅₀/клетку, инкубировали в течение 18 часов, лизировали и переносили в полиакриламидный гель (Any kD Mini-PROTEAN TGX Stain-Free Protein Gel, Bio Rad, США). Разделенные белки переносили на нитроцеллюлозную мембрану (Trans-Blot Turbo Transfer Packs, Bio Rad, США) и окрашивали с использованием моноклональных антител 1Н7 против белка NS1 вируса гриппа [22] с последующим проявлением конъюгатом Goat Anti-Mouse IgG H&L (HRP) (Abcam, Великобритания) и субстратом Pierce 1-Step Ultra TMB-Blotting Solution (Thermo Fisher Scientific, США).

Количественная оценка инфицированных клеток методом проточной цитометрии

Клетки заражали рекомбинантными штаммами в дозе 7.0 log₁₀ ТИД₅₀/клетку и инкубировали в течение 18-20 часов в среде, содержащей 2% сыворотки. Окрашивание проводили набором Zombie Aqua Fixable Viability Kit (BioLegend, США) и FITC-мечеными антителами к нуклеопротеину вируса гриппа А (ППДП, Россия). Для анализа использовали проточный цитометр CytoFLEX (Beckman Coulter, США) и программу Kaluza Analysis v2 (Beckman Coulter, США).

Лабораторные животные

Лабораторные крысы Wistar (самки, 10-12 недель, 250-300 г) были получены из филиала «Столбовая» ФГБУ НЦБМТ ФМБА России. Исследования проводили в соответствии с международными рекомендациями (Директива 2010/63/EU).

Оценка безопасности вируса при интракраниальном введении крысам

Репортерный гриппозный вектор T_NS124-2А-Luc был сконцентрирован и очищен методом ультрафильтрации и диафильтрации в тангенциальном потоке. Препараты вводили интракраниально в мягкую мозговую оболочку крыс в объеме 10 мкл с помощью нанолитрового инъектора RWD Life Science R480 Nanoliter Injection Pump. Наблюдение за клиническим состоянием животных (по 5 крыс в группе) проводили в течение 10 дней с последующей оценкой неврологического дефицита [23]. Персистенцию вируса в месте инъекции оценивали по люминесцентной активности и наличию вирусного генетического материала и его инфекционной активности через 24, 48 и 72 часа после введения препарата двум-трем крысам в экспериментальной группе T_NS124-2А-Luc и одному животному в интактной группе.

Статистическая обработка

Графическую визуализацию и статистическую обработку данных проводили в программах MSExcel и GraphPad Prism v9.5.1. Для проверки гипотезы о нормальности распределений данных использовали критерий Шапиро-Уилка. Если гипотеза о нормальности не могла быть отвергнута, значимость различий между группами определяли в дисперсионном анализе с апостериорным тестом Тьюки. В противном случае использовали тест Краскела-Уоллиса с последующим критерием Данна. Уровень значимости принимали равным 0.05.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Конструирование и характеристика репортерных гриппозных векторов

Репортерные штаммы вируса гриппа, обладающие хемилюминесцентной активностью, были получены методом обратной генетики [19]. Для сборки вирусов были использованы плазмиды, кодирующие модифицированный ген NS, в которых белок-кодирующие последовательности вирусного белка NS1₁₂₄ и люциферазы NanoLuc [24] были либо слиты, либо разделены сайтом 2А, обеспечивающим ко-трансляционное разделение белков. Схематическое изображение химерных генов NS представлено на Рис. 1А.

Рис. 1.

Репортерные гриппозные векторы, обладающие люминесцентной активностью. (А) Схематическое изображение геномных сегментов НА и NS полученных репортерных штаммов. Сайт протеолитического расщепления выделен красным жирным шрифтом. NS1₁₂₄ – последовательность, кодирующая неструктурный белок вируса гриппа A/PR/8/34, укороченный до 124 аминокислотных остатков; Luc – последовательность, кодирующая люциферазу NanoLuc глубоководной креветки Oplophorus gracilirostris; STOP – стоп-кодон; NEP – последовательность, кодирующая белок ядерного экспорта вируса гриппа A/PR/8/34; 2А – последовательность, кодирующая сайт «автопротеолиза» P2А Porcine Teschovirus 1. Дизайн генных сегментов проводили в программе Unipro UGENE [25]. (Б) Электрофореграмма продуктов амплификации геномного сегмента NS репортерных гриппозных векторов. М – маркер молекулярного веса; 1 – репортерный штамм T_NS124-2А-Luc; 2 – штамм E_NS124-2А-Luc; 3 – контрольная плазмида pHW-PR8/NS124-2A-Luc; 4 – штамм E_NS124-Luc; 5 – контрольная плазмида pHW-PR8/NS124-Luc. Для постановки ОТ-ПЦР был использован вирусный материал пятого пассажа для всех штаммов. (В) Результаты Вестерн-блот окрашивания лизатов клеток, инфицированных в дозе 1 ТИД₅₀/клетку, антителами против NS1 (1H7); дорожки 1-4 – клетки, зараженные репортерными гриппозными векторами T_NS124-Luc, E_NS124-Luc, T_NS124-2A-Luc и E_NS124-2A-Luc, соответственно; М – маркер молекулярного веса, кДа; стрелками выделены синтезируемые химерные белки. (Г) Теоретически рассчитанная молекулярная масса химерных белков NS1, экспрессируемых при заражении клеток сконструированными репортерными векторами (с использованием сервера ExPASy ProtParam [26]).

Для изменения специфичности к протеолитическим ферментам в плазмиду, кодирующую гемагглютинин (НА) штамма вируса гриппа A/PR/8/34, были введены точечные мутации S342→P и R343→I, приводящие к замене сайта протеолитического расщепления с трипсинового на эластазный (Рис. 1А). Остальные гены были заимствованы от лабораторного штамма A/PR/8/34.

В результате был получен набор из четырех репортерных векторов: вирусы T_NS124-Luc и T_NS124-2A-Luc содержали НА, расщепляемый трипсин-подобными сериновыми протеазами; штаммы E_NS124-Luc и E_NS124-2A-Luc содержали модифицированный НА, активируемый эластазой.

Генетическая стабильность и репродуктивная активность сконструированных векторов

Все сконструированные векторы были генетически стабильны на протяжении пяти последовательных пассажей. На Рис. 1Б приведены результаты ОТ-ПЦР, демонстрирующие соответствие длины геномного сегмента NS пятого пассажа штаммов контрольным плазмидам. Продукты амплификации геномного сегмента NS клонов предыдущих пассажей также соответствовали контрольным плазмидам (данные не представлены). Биолюминесцентный сигнал для всех штаммов достигал 10⁵ ОЕ. Экспрессия химерного белка NS1 была подтверждена при анализе лизата клеток методом Вестерн-блот анализа (Рис. 1В). Соответствие молекулярных масс синтезируемых химерных белков теоретически предсказанному было подтверждено методом окрашивания нитроцеллюлозной мембраны антителами к белку NS1 (Рис. 1Г). Также было продемонстрировано частичное ко-трансляционное разделение химерного белка в сайте «проскока рибосомы» 2А (Рис. 1В, дорожки 3 и 4).

Репродуктивная активность трипсин-зависимых и эластазо-зависимых репортерных штаммов достигала 8.0 log₁₀ ТИД₅₀/мл при культивировании в клеточных линиях Vero и MDCK. Ростовые характеристики рекомбинантных вирусов в отсутствие экзогенных протеаз в системе РКЭ ожидаемо различались. Инфекционная активность трипсин-зависимых штаммов T_NS124-Luc и T_NS124-2A-Luc в РКЭ достигала 9.0 log₁₀ ЭИД₅₀/мл. В то же время эластазо-зависимые вирусы E_NS124-Luc и E_NS124-2А-Luc не реплицировались в куриных эмбрионах без добавления экзогенной эластазы. Наличие сайта ко-трансляционного разделения 2А не оказывало существенного влияния на инфекционную активность штаммов, что свидетельствовало о сохранении их функциональной активности и стабильности конструкции.

Для подтверждения специфичности протео-литического расщепления НА трипсином и эластазой проводили оценку репродуктивной и репортерной активности сконструированных штаммов при культивировании вирусов в средах, содержащих как гомологичные, так и гетерологичные протеазы (Рис. 2).

Рис. 2.

Репродуктивная и люминесцентная активность репортерных гриппозных векторов. (А) Кривая роста репортерных гриппозных векторов в присутствии TPCK-трипсина или эластазы. (Б) Люминесцентная активность штаммов с модифицированным белком NS1, зависимых от эластазы или от TPCK-трипсина. Суточный монослой клеток MDCK заражали в дозе 0.001 ТИД₅₀/клетку в трех независимых повторах для каждого вируса и анализировали в течение 72 часов. Скорость репродукции штаммов при многоцикловой инфекции оценивали в супернатанте зараженных клеток с помощью титрования образовавшегося вирусного потомства в клетках MDCK в присутствии гомологичной протеазы. Пунктирной линией обозначен предел чувствительности метода. Люциферазную активность определяли в клеточном лизате; ОЕ – оптические единицы.

Инкубация клеток, зараженных репортерными вирусными штаммами, в среде с гомогенной протеазой инициировала многоцикловую инфекцию. Пик репродуктивной активности был зафиксирован через 48 часов после заражения и составил 7.7 log₁₀ ТИД₅₀/мл для трипсин-зависимых штаммов и 7.0 log₁₀ ТИД₅₀/мл для эластазо-зависимых вирусов. Присутствие сайта 2А между последовательностями белка NS1₁₂₄ и люциферазы NanoLuc не влияло на скорость репродукции вирусов, что подтверждает универсальность данной конструкции.

Люциферазная активность штаммов, растущих в среде, содержащей гетерологичную протеазу, не превышала 10³ ОЕ, достигая пика к 24 часам. Среди всех штаммов наиболее высокий уровень люминесцентного сигнала в условиях добавления гетерологичной протеазы был зарегистрирован для трипсин-зависимого вируса со вставкой 2А сайта.

Инкубация зараженных клеток в среде с гомологичной протеазой обеспечивала интенсивное люминесцентное свечение, достигающее 10⁵ ОЕ, что подтверждает специфичность сайта протеолитического расщепления НА. Пик люциферазной активности для трипсин-зависимых вирусов детектировали через 24 часа после инфекции, а для эластазо-зависимых штаммов – через 48 часов.

Таким образом были сконструированы и охарак-теризованы генетически стабильные репортерные гриппозные векторы, репродукция которых зависела от наличия трипсина (T_NS124-Luc и T_NS124-2А-Luc) или эластазы (E_NS124-Luc и E_NS124-2А-Luc). Все вирусы демонстрировали высокую люминесцентную активность, достигающую 10⁵ ОЕ в присутствии соответствующего протеолитического фермента. Репортерная и инфекционная активность штаммов не зависела от присутствия сайта 2А перед последовательностью люциферазы NanoLuc.

Эффективность инфицирования глиомных клеточных линий сконструированными штаммами

Для оценки онколитического потенциала разработанных репортерных штаммов была изучена их способность инфицировать опухолевые клеточные культуры. В качестве модели опухоли использовали клеточную линию глиомы крысы С6, первичную культуру Т2 [27] и перевиваемые клеточные линии глиобластомы человека А172 и Т98G. Для сравнения была использована пермиссивная культура клеток MDCK.

Долю инфицированных клеток определяли методом проточной цитометрии с использованием флуоресцентно меченных моноклональных антител против нуклеопротеина (NP) вируса гриппа. Полученные данные позволили определить эффективность заражения различных клеточных линий (Рис. 3).

Рис. 3.

Эффективность инфицирования клеток репортерными векторами. Суточный монослой клеток (А) MDCK, (Б) глиомы крысы С6, (В) А172, (Г) Т98G и (Д) Т2 заражали в дозе 7.0 log₁₀ ТИД₅₀/клетку в трех независимых повторах для каждого вируса и инкубировали в течение 17 часов в среде, содержащей 2% сыворотки. В качестве отрицательного контроля использовали незараженные клетки (КК); % зараженных клеток считали с помощью проточного цитометра, окрашивая клетки набором Zombie Aqua Fixable Viability Kit и FITC-мечеными антителами к NP вируса гриппа А. * – p<0.05; ** – p<0.01, *** – p<0.001 (двухфакторный анализ ANOVA с последующим апостериорным тестом Тьюки).

Наибольшая эффективность инфицирования клеток сконструированными репортерными векторами была зафиксирована в клеточной линии глиомы крысы С6 и первичной культуры глиобластомы Т2 [27]. В клеточных линиях глиобластомы человека A172 и T98G процент инфицированных клеток оказался ниже, составляя около 50% от уровня инфицирования пермиссивной линии MDCK.

Примечательно, что векторы T_NS124-2A-Luc и E_NS124-2A-Luc, содержащие 2А сайт в химерном гене ns1, демонстрировали значительно более высокий процент инфицированных клеток по сравнению с вирусами T_NS124-Luc и E_NS124-Luc, не содержащими 2А сайт (p<0.05, Рис. 3). Это указывает на потенциальную роль 2А сайта в улучшении способности векторов заражать клетки глиомы.

Безопасность вектора при интракраниальном введении

Ключевым этапом разработки онколитической терапии глиобластом является оценка безопасности изучаемого препарата при интракраниальном введении в мягкую мозговую оболочку здоровым животным. Для исследования безопасности был выбран предварительно очищенный и сконцентрированный до 9 log₁₀ ЭИД₅₀/мл штамм T_NS124-2А-Luc. План эксперимента представлен на Рис. 4A. Наблюдение за животными проводили на ежедневной основе в течение 10 дней. В этот период снижения массы тела животных и летальных исходов зафиксировано не было (Рис. 4Б).

Рис. 4.

Оценка безопасности репортерного гриппозного штамма при интракраниальном введении. Предварительно очищенный репортерный вектор T_NS124-2A-Luc вводили крысам Wistar интракраниально в дозе 7.0 log₁₀ ТИД₅₀/животное в 10 мкл. В качестве контрольного препарата вводили буфер SPGN в том же объеме. С интактными животными манипуляций, связанных с введением препарата, не проводили. (А) Схема эксперимента. (Б) Динамика массы тела животных (n=5 в группе) в течение 10 дней после интракраниального введения репортерного вектора T_NS124-2A-Luc. (В) Люминесцентная активность. (Г) Присутствие вирусной РНК и (Д) инфекционная нагрузка в гомогенате ткани головного мозга животных контрольной (n=1) и экспериментальной групп через 24 (n=2), 48 (n=3) и 72 часа (n=2) после введения. (Е) Прижизненная визуализация репортерного вектора через 2–24 часа после интракраниального введения препарата.

Рис. 5.

Результаты физиологических тестов. Репортерный вектор T_NS124-2A-Luc вводили крысам интракраниально в дозе 7.0 log₁₀ ТИД₅₀/животное (n=5). В качестве контрольных групп были использованы интактные крысы (без интракраниального введения препаратов, n = 5) и крысы, которым вводили буфер SPGN (n=5). Физиологические тесты для оценки неврологического дефицита проводили на день 10 после введения препаратов.

Для изучения персистенции вируса в головном мозге крысы оценивали люминесцентную активность вектора, присутствие генетического материала вируса и его инфекционную активность в течение первых 72 часов после введения (Рис. 4В-Д).

Во всех исследованных образцах ткани головного мозга во всех временных точках наблюдали высокий уровень люминесцентного сигнала (до 10⁵ ОЕ), достаточный для прижизненной визуализации NanoLuc в составе гриппозного вектора (Рис. 4Е).

Примечательно, что инфекционную нагрузку и вирусную РНК в образцах головного мозга уже через 72 часа после введения вектора обнаружить не удалось. Эти данные подтверждают ограниченную репликацию вируса и его быстрое выведение из тканей головного мозга, что свидетельствует о безопасности репортерного вектора.

При изучении общей двигательной активности и поисково-исследовательского поведения животных статистически значимых различий между экспериментальной и контрольной группами не выявлено (Рис. 5). Полученные данные свидетельствуют об отсутствии неврологических нарушений у лабораторных животных после интракраниального введения репортерного вектора.

Таким образом, интракраниальное введение репортерного гриппозного вектора было безопас-ным для крыс, не вызывало неврологического дефицита, и сопровождалось синтезом люциферазы NanoLuc, детектируемой прижизненно in situ в месте введения.

ОБСУЖДЕНИЕ

В настоящее время использование онколитических вирусов считается перспективным методом иммунотерапии глиобластом. Подтверждением этому является большое количество клинических исследований различных онколитических вирусных кандидатов, включая вирусы герпеса (HSV-1), реовирус (Reovirus, Reolysin), аденовирусы, вирус везикулярного стоматита (VSV), парамиксовирусы (вирус кори, вирус болезни Ньюкасла), вирус оспы коров, вирус Сендай и полиовирус [1-6, 28, 29]. Данные вирусы обладают способностью не только напрямую разрушать опухолевые клетки, но и модифицировать опухолевое микроокружение, усиливая противоопухолевый иммунный ответ [28, 30]. Вирусы гриппа, благодаря своей способности стимулировать врожденный иммунитет и цитотоксический Т-клеточный ответ, представляют собой перспективные кандидаты для онколитической терапии [31-33]. Однако их применение сопряжено с рядом ограничений и вызовов.

Одной из ключевых проблем является наличие нейтрализующих антител к современным штаммам вируса гриппа А, что связано с частыми сезонными эпидемиями и массовой вакцинацией [34]. Это может значительно снизить эффективность гриппозных векторов в качестве онколитических агентов. Альтернативой является использование «старых» вирусов гриппа, к которым в популяции отсутствует иммунитет, но такие вирусы несут риски вирулентности, генетической нестабильности и потенциального эпидемического распространения. Кроме того, некоторые штаммы вируса гриппа обладают нейротропностью, что может приводить к неврологическим осложнениям, в связи с чем требуется тщательная оценка их безопасности [35, 36].

Несмотря на эти ограничения, вирусы гриппа обладают уникальными характеристиками, позволяющими создавать гиператтенуированные векторы для целевой экспрессии трансгенов, таких как цитокины и хемокины, в зоне опухолевого роста [7, 8]. Эти трансгены могут усиливать противоопухолевый иммунный ответ, активируя Т клетки, NK клетки и макрофаги, а также способствуя инфильтрации иммунных клеток в опухоль [7].

В рамках настоящего исследования были разработаны репортерные векторы вируса гриппа, активируемые трипсиноподобными протеазами (T_NS124-Luc, T_NS124-2A-Luc) или опухоль-ассоциированной эластазой (E_NS124-Luc, E_NS124-2A-Luc). Для этого в сайт расщепления HA были внесены мутации S342→P и R343→I. Векторы показали высокую эффективность заражения клеточных линий глиом (С6, T2, А172, T98G), при этом отмечена повышенная инфекционная активность конструкций с сайтом 2A, обеспечивающим ко-трансляционное разделение белков. Это может быть связано с улучшением функциональной активности белка NS1 при его разделении с трансгеном.

Эксперименты in vivo показали, что интракраниальное введение трипсино-зависимого вектора T_NS124-2A-Luc в высокой дозе было безопасно для крыс и не приводило к развитию неврологического дефицита. При этом люминесцентный репортер NanoLuc экспрессировался в месте введения вектора, что позволило визуализировать зону введения вируса. Важно отметить, что экспрессию трансгена наблюдали в отсутствии активной вирусной репликации.

Полученные результаты открывают перспективы дальнейшей оптимизации вирусных векторов, изучения фармакокинетики трансгенов и разработки онколитических препаратов на основе вируса гриппа, экспрессирующих цитокины и хемокины. Кроме того, векторы, экспрессирующие NanoLuc, могут обладать собственным терапевтическим эффектом за счёт иммуномодулирующего действия модифицированного белка NS1. Замена NanoLuc на хемокины, такие как CXCL-9/10/11, может усилить терапевтический эффект векторов, способствуя активации противоопухолевого иммунитета и модификации микроокружения опухоли [7, 37]. Это направление станет основой для дальнейших исследований, направленных на создание безопасных и эффективных онколитических препаратов для терапии злокачественных глиом.

Финансирование:

Работа выполнена в рамках государственного задания Министерства здравоохранения Российской Федерации на 2024-2026 гг. «Доклинические исследования и разработка готовой лекарственной формы препарата онколитического вектора на основе модифицированного вируса гриппа А для комплексной терапии злокачественных глиом».

Конфликт интересов:

Авторы подтверждают отсутствие конфликта интересов.

СПИСОК ИСТОЧНИКОВ

1. Wu W, Klockow JL, Zhang M, Lafortune F, Chang E, Jin L, et al. Glioblastoma multiforme (GBM): An overview of current therapies and mechanisms of resistance, Pharmacological Research. 2021;171:105780. https://doi.org/10.1016/j.phrs.2021.105780.

2. Kotecha R, Odia Y, Khosla AA, Ahluwalia MS. Key Clinical Principles in the Management of Glioblastoma. JCO Oncol Pract. 2023;19(4):180-9. https://doi.org/10.1200/OP.22.00476.

3. Bernstock JD, Blitz SE, Hoffman SE, Gerstl JVE, Chiocca EA, Friedman GK. Recent oncolytic virotherapy clinical trials outline a roadmap for the treatment of high-grade glioma. Neurooncol Adv. 2023;5(1):081. http://www.doi.org/10.1093/noajnl/vdad081.

4. Lin D, Shen Y, Liang T. Oncolytic virotherapy: basic principles, recent advances and future directions. Sig Transduct Target Ther. 2023;8:156. https://doi.org/10.1038/s41392-023-01407-6.

5. Bartlett DL, Liu Z, Sathaiah M, Ravindranathan R, Guo Z, He Y, Guo ZS. Oncolytic viruses as therapeutic cancer vaccines. Mol Cancer. 2013;12(1):103. https://doi.org/10.1186/1476-4598-12-103.

6. Vorobjeva IV, Zhirnov OP. Modern approaches to treating cancer with oncolytic viruses. MIR J. 2022;9(1):91-112. https://doi.org/10.18527/2500-2236-2022-9-1-91-112.

7. Pol JG, Workenhe ST, Konda P, Gujar S, Kroemer G. Cytokines in oncolytic virotherapy. Cytokine Growth Factor Rev. 2020;56:4-27. https://doi.org/10.1016/j.cytogfr.2020.10.007.

8. Tokunaga R, Zhang W, Naseem M, Puccini A, Berger MD, Soni S, et al. CXCL9, CXCL10, CXCL11/ CXCR3 axis for immune activation - A target for novel cancer therapy. Cancer Treat Rev. 2018;63:40-7. https://doi.org/10.1016/j.ctrv.2017.11.007.

9. Kabiljo J, Laengle J, Bergmann M. From threat to cure: understanding of virus-induced cell death leads to highly immunogenic oncolytic influenza viruses. Cell Death Discov. 2020;6:48. https://doi.org/10.1038/s41420-020-0284-1.

10. Ogbomo H, Michaelis M, Geiler J, van Rikxoort M, Muster T, Egorov A, et al. Tumor cells infected with oncolytic influenza A virus prime natural killer cells for lysis of resistant tumor cells. Med Microbiol Immunol. 2010;199(2):93-101. https://doi.org/10.1007/s00430-009-0139-0.

11. Sturlan S, Stremitzer S, Bauman S, Sachet M, Wolschek M, Ruthsatz T, et al. Endogenous expression of proteases in colon cancer cells facilitate influenza A viruses mediated oncolysis. Cancer Biol Ther. 2010;10(6):592-9. https://doi.org/10.4161/cbt.10.6.12565.

12. Hock K, Laengle J, Kuznetsova I, Egorov A, Hegedus B, Dome B, et al. Oncolytic influenza A virus expressing interleukin-15 decreases tumor growth in vivo. Surgery. 2017;161(3):735-6. https://doi.org/10.1016/j.surg.2016.08.045.

13. Shurygina APS, Kartashev AV, Kovanko EG, Kiseleva LN, Pustovalov YI, Slita AK, et al. Oncolytic potential of recombinant influenza A virus vectors on a model of malignant glioma in vivo. Vopr Onkol. 2016;62(1):138-45. (In Russian). PMID: 30444592.

14. Kabiljo J, Kuznetsova I, Homola J, Prodinger S, Laengle J, Sachet M, et al. P09.04 Oncolytic H5N1 influenza strain displays superior therapeutic properties independent of immuno-stimulatory interleukin-2 transgene expression J Immunother Cancer. 2020;8(Suppl 2). https://doi.org/10.1136/jitc-2020-ITOC7.104.

15. Kuznetsova I, Arnold T, Aschacher T, Schwager C, Hegedus B, Garay T, et al. Targeting an Oncolytic Influenza A Virus to Tumor Tissue by Elastase. Mol Ther Oncolytics. 2017;7:37-44. http://www.doi.org/10.1016/j.omto.2017.09.002.

16. Sergeeva MV, Pulkina AA, Romanovskaya-Romanko EA, Mustafaeva AS, Egorov AY, Stukova MA. Rapid Assessment of Neutralizing Antibodies Using Influenza Viruses with a Luciferase Reporter. Appl Biochem Microbiol. 2022;58(7):878-86. https://doi.org/10.1134/S0003683822070067.

17. Pulkina AA, Sergeeva MV, Krokhin A, Stukova MA, Egorov A. Evidence for the extracellular delivery of influenza NS1 protein. MIR J. 2021;8(1):7-37. https://doi.org/10.18527/2500-2236-2021-8-1-27-37.

18. Kim JH, Lee SR, Li LH, Park HJ, Park JH, Lee KY, et al. High cleavage efficiency of a 2A peptide derived from porcine teschovirus-1 in human cell lines, zebrafish and mice. PLoS One. 2011;6(4):e18556. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0018556.

19. Hoffmann E, Neumann G, Kawaoka Y, Hobom G, Webster RG. A DNA transfection system for generation of influenza A virus from eight plasmids. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2000;97:6108-13. https://doi.org/10.1073/pnas.100133697.

20. Reed LJ,Muench H.Asimple method of estimating fifty per cent endpoints. Am J Epidemiol. 1938;27:493-7. https://doi.org/10.1093/oxfordjournals.aje.a118408.

21. Hoffmann E, Stech J, Guan Y, Webster RG, Perez DR. Universal primer set for the full-length amplification of all influenza A viruses. Arch Virol. 2001;146(12):2275-89. https://doi.org/10.1007/s007050170002.

22. Krivitskaya VZ, Sorokin EV, Tsareva TR, Sergeeva MV, Kadyrova RA, Romanovskaya-Roman’ko EA, et al. Generation and Characterization of the Monoclonal Antibody Panel Specific to the NS1 Protein of the Influenza A Virus. Appl Biochem Microbiol. 2018;54:756. https://doi.org/10.1134/S0003683818070049.

23. Basso DM, Beattie MS, Bresnahan JC. A sensitive and reliable locomotor rating scale for open field testing in rats. J Neurotrauma. 1995;12:1-21. https://doi.org/10.1089/neu.1995.12.1.

24. Hall MP, Unch J, Binkowski BF, Valley MP, Butler BL, Wood MG, et al. Engineered luciferase reporter from a deep sea shrimp utilizing a novel imidazopyrazinone substrate. ACS Chem Biol. 2012;7(11):1848-57. http://www.doi.org/10.1021/cb3002478.

25. Okonechnikov K, Golosova O, Fursov M; UGENE team. Unipro UGENE: a unified bioinformatics toolkit. Bioinformatics. 2012;28(8):1166-7. http://www.doi.org/10.1093/bioinformatics/bts091.

26. Wilkins MR, Gasteiger E, Bairoch A, Sanchez JC, Williams KL, Appel RD, Hochstrasser DF. Protein identification and analysis tools in the ExPASy server. Methods Mol Biol. 1999;112:531-52. https://doi.org/10.1385/1-59259-584-7:531.

27. Kiseleva LN, Kartashev AV, Vartanyan NL, Pinevich AA, Filatov MV, Samoilovich MP. Characterization of New Human Glioblastoma Cell Lines. Cell Tiss. Biol. 2018;12:1-6. https://doi.org/10.1134/S1990519X18010108.

28. Hamad A, Yusubalieva GM, Baklaushev VP, Chumakov PM, Lipatova AV. Recent Developments in Glioblastoma Therapy: Oncolytic Viruses and Emerging Future Strategies. Viruses. 2023,15:547. https://doi.org/10.3390/v15020547.

29. Macedo N, Miller DM, Haq R, Kaufman HL. Clinical landscape of oncolytic virus research in 2020. J Immunother Cancer. 2020;8(2):e001486. http://www.doi.org/10.1136/jitc-2020-001486.

30. Berkey SE, Thorne SH, Bartlett DL. Oncolytic Virotherapy and the Tumor Microenvironment. Adv Exp Med Biol. 2017;1036:157-72. http://www.doi.org/10.1007/978-3-319-67577-0_11.

31. Muster T, Rajtarova J, Sachet M, Unger H, Fleischhacker R, Romirer I, et al. Interferon resistance promotes oncolysis by influenza virus NS1-deletion mutants. Int J Cancer. 2004;110(1):15-21. http://www.doi.org/10.1002/ijc.20078.

32. Sun F, Xu Y, Deng Z, Yang P. A recombinant oncolytic influenza virus expressing a PD-L1 antibody induces CD8+ T-cell activation via the cGas-STING pathway in mice with hepatocellular carcinoma. Int Immunopharmacol. 2023;120:110323. https://doi.org/10.1016/j.intimp.2023.110323.

33. Li C, Tian Y, Sun F, Lei G, Cheng J, Tian C, et al. A Recombinant Oncolytic Influenza Virus Carrying GV1001 Triggers an Antitumor Immune Response. Hum Gene Ther. 2024;35(1-2):48-58. https://doi.org/10.1089/hum.2022.206.

34. Gerlach T, Elbahesh H, Saletti G, Rimmelzwaan GF. Recombinant influenza A viruses as vaccine vectors. Expert Rev Vaccines. 2019;18(4):379-92. https://doi.org/10.1080/14760584.2019.1582338.

35. Ekstrand JJ. Neurologic complications of influenza. Semin Pediatr Neurol. 2012;19(3): 96-100. https://doi.org/10.1016/j.spen.2012.02.004.

36. Khandaker G, Zurynski Y, Buttery J, Marshall H, Richmond PC, Dale RC, et al. Neurologic complications of influenza A(H1N1)pdm09: surveillance in 6 pediatric hospitals. Neurology. 2012;79(14):1474-81. https://doi.org/10.1212/WNL.0b013e31826d5ea7.

37. Nagarsheth N, Wicha MS, Zou W. Chemokines in the cancer microenvironment and their relevance in cancer immunotherapy. Nat Rev Immunol. 2017;17(9):559-72. http://www.doi.org/10.1038/nri.2017.49.