Однократная интраназальная иммунизация высокой дозой гриппозного вектора вызывает защитный эффект при заражении гетерологичным вирусом гриппа и SARS-CoV-2 у хорьков и хомяков Translated title: Single intranasal immunization with a high dose of influenza vector causes a protective effect against infection with heterologous influenza virus and SARS-CoV-2 in ferrets and hamsters

Abstract

ПРЕДПОСЫЛКИ: Проблема эффективности вакцинации в отношении вирусов, претерпевающих постоянные антигенные изменения в процессе эволюции, в настоящее время решается за счет обновления состава вакцин для обеспечения соответствия циркулирующим штаммам. В случае внезапного появления в популяции вируса, значительно отличающегося от циркулирующего (антигенный шифт или дрейф), или нового вируса, каким стал SARS-CoV-2, этот подход не работает. В связи с этим существует необходимость создания универсальной вакцины, индуцирующей Т-клеточный иммунный ответ к консервативным антигенным детерминантам вируса.

ЦЕЛЬ ИССЛЕДОВАНИЯ: Получение вакцинного кандидата на основе аттенуированного гриппозного вектора для иммунизации с целью индукции защиты от гетерологичного вируса гриппа и коронавируса.

МЕТОДЫ: На основе вируса гриппа A/Puerto Rico/8/1934 (H1N1) (PR/8/34) был сконструирован рекомбинантный вектор FluCoV-N, содержащий аттенуирующие мутации в генах ns1 и nep и экспрессирующий N-концевую последовательность белка N (N_1-209) вируса SARS-CoV-2. Для моделирования защиты хорьков от гриппа через 25 дней после однократной вакцинации вектором в дозе 9.4 log₁₀ЭИД₅₀ их заражали гетерологичным штаммом вируса гриппа A/Austria/1516645/2022 (H3N2). Для проверки защиты хомяков от коронавируса проводили их однократную иммунизацию вектором в дозе 8.2 log₁₀ЭИД₅₀, а через 21 день их инфицировали SARS-CoV-2.

РЕЗУЛЬТАТЫ: Полученный вектор характеризовался температурочувствительностью (ts), способностью к стимуляции системы интерферонов I типа (IFN I) и безвредностью для животных при интраназальном применении в высокой дозе. Однократная интраназальная иммунизация хорьков FluCoV-N приводила к ускоренному разрешению инфекции, вызванной гетерологичным вирусом гриппа H3N2. Аналогичная иммунизация хомяков обеспечивала снижение титров вируса SARS-CoV-2 в легких в 10000 раз на второй день после инфекции и уменьшала патологию в легких животных.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ: Однократная интраназальная иммунизация хорьков или хомяков гриппозным вектором FluCoV-N защищала животных, ослабляя развитие заболевания, вызванного гетерологичным вирусом гриппа или SARS-CoV-2 соответственно.

Translated abstract

BACKGROUND: The challenge of vaccine effectiveness against viruses that undergo constant antigenic changes during evolution is currently being addressed by updating vaccine formulations to match circulating strains. However, this approach proves ineffective if a virus undergoes antigenic drift and shift, or if a new virus, such as SARS-CoV-2, emerges and enters circulation. Hence, there is a pressing need to develop universal vaccines that elicit a T-cell immune response targeting conserved antigenic determinants of pathogens.

OBJECTIVE: To develop a vaccine candidate against influenza virus and coronavirus based on an attenuated influenza vector.

METHODS: In pursuit of this objective, we developed a recombinant influenza vector named FluCoV-N. It incorporates attenuating modifications in the ns1 and nep genes and expresses the N-terminal half of the N protein (N_1-209) of the SARS-CoV-2 virus. To assess the vector’s protective efficacy against influenza, ferrets were infected with heterologous influenza A/Austria/1516645/2022 (H3N2) virus on the 25th day after a single immunization with 9.4 log₁₀EID₅₀ of the studied vector. To test protection against coronavirus, hamsters were immunized once with the vector at a dose of 8.2 log₁₀EID₅₀ and challenged with SARS-CoV-2 virus 21 days later.

RESULTS: As a result of modifications to the NS genomic segment, the constructed vector acquired a temperature-sensitive (ts) phenotype and demonstrated a heightened ability to induce type 1 interferons. It was harmless to animals when administered intranasally at high doses exceeding 8.0 log₁₀EID₅₀. In ferrets, a single intranasal immunization with FluCoV-N accelerated the resolution of infection caused by heterologous influenza H3N2 virus. Similar immunization in hamsters led to a 10,000-fold reduction in SARS-CoV-2 viral titers in the lungs on the second day after challenge and reduced pathology in the lungs of animals.

CONCLUSION: A single intranasal immunization with the FluCoV-N vector protected from heterologous influenza or SARS-CoV-2 viruses in ferrets and hamsters.

Main article text

ВВЕДЕНИЕ

Эффективная борьба с респираторными вирусными патогенами требует создания новых вакцин, эффективных против быстро мутирующих вирусов. Пандемия SARS-CoV-2 продемонстрировала высокую эффективность массовой вакцинации с помощью векторных аденовирусных и mRNA вакцин [1]. Однако вакцинная компания против COVID-19 наглядно показала способность SARS-CoV-2 уклоняться от действия нейтрализующих антител, образующихся при вакцинации или естественной инфекции [2]. Эффект снижения эффективности вакцин против COVID-19 был отмечен с появлением Дельта и Омикрон мутантов SARS-CoV-2, вызывающих у привитых индивидуумов повторные заболевания [3, 4]. Дальнейшая циркуляция SARS-CoV-2 в популяции ведет к селекции новых мутантных вариантов, что вызывает необходимость постоянного обновления вакцин, созданных на основе S белка.

Вакцинопрофилактика COVID-19 в этом отношении схожа с защитой от гриппозной инфекции, когда антигенный дрейф и шифт вируса гриппа являются причиной постоянного обновления противогриппозных вакцин. Поскольку вирус гриппа способен вызывать глобальные эпидемии и пандемии, приводя к значительному количеству смертельных исходов и тяжелых осложнений [5, 6], ежегодная вакцинация остается одним из наиболее эффективных методов борьбы с данной инфекцией [7].

В настоящее время для профилактики гриппа используют два типа вакцин: инактивированные вакцины, вводимые внутримышечно или подкожно, и живые аттенуированные вакцины. Каждая из вакцин получена на основе 3-4 актуальных штаммов вируса гриппа. Большинство лицензированных вакцин против сезонного гриппа представляют собой инактивированные вакцины, отличающиеся по технологии производства, а именно: цельновирионные, сплит- или субъединичные вакцины. Живые вакцины лицензированы в США и Европе для вакцинации детей и сублицензированы в Китае и Индии [8, 9]. Живая аттенуированная, холодоадаптивная вакцина вводится интраназально (i.n.) и предусматривает эффективную репликацию вакцинных штаммов в верхнем респираторном тракте прививаемых. Для повышения эффективности вакцинации против гриппа ведутся исследования по созданию универсальной вакцины, обеспечивающей перекрестно-реагирующий (гетеросубтипический) иммунитет, защищая от новых дрейф- и шифт-вариантов вируса гриппа [10]. При создании универсальной вакцины против гриппа живая i.n. вакцина имеет больше преимуществ, поскольку, в отличие от инактивированной, индуцирует мукозальный иммунитет в респираторном тракте за счет секреторных иммуноглобулинов класса А (sIgA) и резидентных Т-клеток (Trm), обеспечивая более широкую кросс-реактивную защиту за счет взаимодействия с консервативными эпитопами вирусов [11-14].

Ранее мы показали возможность создания живых аттенуированных рекомбинантных вирусных векторов, полученных путем модификации NS1 белка вируса гриппа [15-17]. Вирусы с укороченным NS1 белком обладали повышенной стимуляцией клеток врожденного иммунитета с усиленной антигенпрезентирующей функцией за счет образования полифункциональных Т-лимфоцитов, ответственных за распознавание широкого спектра антигенов вируса гриппа [18, 19]. Рекомбинантные штаммы, экспрессирующие чужеродный антиген в процессе репродукции с рамки считывания NS1 белка, проявили защитную активность как от гомологичных, так и от гетерологичных штаммов вируса гриппа на различных экспериментальных моделях [20-25]. Живая аттенуированная вакцина, в которой вместо NS1 был вставлен рецептор-связывающий домен (receptor binding domain, RBD) SARS-CoV-2, индуцировала системный и мукозальный иммунные ответы и блокировала размножение вируса SARS-CoV-2 в мышиной модели [26]. В исследованиях на людях (фаза 1 и 2) была продемонстрирована безопасность и иммуногенность данного вектора для взрослых добровольцев [27].

В рамках концепции создания универсальной вакцины против гетерологичных штаммов вируса гриппа мы сконструировали оригинальный вектор на основе вируса гриппа A/Puerto Rico/8/1934 (PR/8/34), содержащий не только делецию в ns1 гене, но и гетерологичный ген nep, заимствованный от вируса гриппа другого подтипа A/Singapore/1/57 (H2N2) (патент PCT WO 2014/168522). Рекомбинантный вирус приобрел ts фенотип, характерный для холодоадаптированных гриппозных вакцин, и цитокиногенность, присущую NS1 мутантам вируса гриппа [28, 29]. Дополнительно в вектор была введена часть последовательности белка N_1-209 коронавируса SARS-CoV-2, соединенная с транкированной последовательностью, кодирующей белок NS1_1-124. Несмотря на существенную реконструкцию генома, вакцинный вектор обладал способностью к репродукции в 10-дневных куриных эмбрионах до титров 9.5 log₁₀ ЭИД₅₀/мл (50% эмбриональных инфекционных доз). Одновременно высокая степень аттенуации вектора позволила проводить i.n. иммунизацию животных в дозе, превышающей 8.0 log₁₀ ЭИД₅₀/мл, без нежелательных токсических эффектов. Цель данного исследования состояла в изучении протективного иммунитета в отношении SARS-CoV-2 и гетерологичного вируса гриппа после однократной иммунизации вектором хорьков и хомяков.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Вирусы

Вирус A/Austria/1516645/2022 (H3N2) был получен из коллекции Института вирусологии (Вена, Австрия). Вирус был выделен от больного гриппом и прошел 5 пассажей на культуре Vero в бессывороточной среде OptiPRO (Gibco™) при 37°C и 5% CO₂ с добавлением 2 mM GlutaMAX™ (Thermo Fisher) и 1 мг/мл трипсина, как описано ранее [30].

Для заражения вакцинированных хомяков использовали лабораторный штамм SARS-CoV-2 (GenBank: MW161041.1), выделенный на культуре клеток Vero CCL81 из назофарингеального мазка больного СOVID-19 исоответствующийпоантигенным свойствам вирусу Wuhan. Культивирование вируса проводили при 37°C в питательной среде DMEM с L-глутамином (300 мкг/мл), глюкозой (4.5 г/л), 5%-ной фетальной телячьей сывороткой (fetal calf serum, FCS), гентамицином (40 мкг/мл) в атмосфере 5% СО₂. Штамм прошел 20 последовательных пассажей и вызывал выраженное цитопатическое действие на клетках. Образцы вирусного материала хранили при температуре -80°C в виде аликвот.

Клеточные культуры

Получение и культивирование рекомбинантного штамма проводили на клеточной культуре Vero, которая была получена из Американской коллекции клеточных культур и вирусов (АТТС). Клетки альвеолярного базального эпителия карциномы человека (A549) (получены от J. Seipelt, Австрия) культивировали в MEM с добавлением 10% FCS (Gibco™) и 2 мМ L-глутамина.

Для титрования легочной суспензии хомяков использовали перевиваемую культуру Vero, полученную из АТТС, культивированную в ростовой среде DMEM, с добавлением 10% инактивированной нагреванием FCS (ПанЭко, Россия), 2 мМ L-глутамина (Sigma, США) и антибиотиков (100 Ед/мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина). Поддерживающая среда содержала все указанные выше ингредиенты и 2% сыворотки. Клетки инкубировали при 37°C и 5% СО₂.

Конструирование вектора

Конструирование рекомбинантного вируса гриппа FluCoV-N осуществляли с помощью метода обратной генетики [31, 32]. Были использованы следующие плазмиды, полученные синтетическим путем (GeneArt, Германия): pHW-PR8-HA, кодирующая HA вируса гриппа PR/8/34 (H1N1) (GenBank: CY033577), pHW-PR8-NA, кодирующая NA вируса A/PR/8/34 (H1N1) (GenBank: EF467823), pHW-PR8-PB2, кодирующая PB2 геномный сегмент A/PR/8/34 (H1N1) (Genbank: AB671295), pHW-PR8-PB1, кодирующая PB1 сегмент A/PR/8/34 (H1N1) (Genbank: CY033583), pHW-PR8-PA, кодирующая PA сегмент A/PR/8/34 (H1N1) (Genbank: AF389117), pHW-PR8-NP, кодирующая NP сегмент A/PR/8/34 (H1N1) (Genbank AF389119), pHW-PR8-M, кодирующая M сегмент A/PR/8/34 (H1N1) (Genbank AF389121). Плазмида pHW-PR8-NN_c содержала химерный ns ген, кодирующий транкированный NS1₁₂₄ вируса гриппа и N-терминальную часть N_1-209 белка вируса SARS-CoV-2. Клетки трансфицировали полным набором плазмид, кодирующих 7 геномных фрагментов вируса гриппа (PB2, PB1, PA, HA, NA, NP и M) в комбинации с плазмидой, кодирующей химерный NS фрагмент. Клетки Vero для трансфекции пассировали в среде OptiPRO (не выше 150 пассажа), содержащей 10% FCS (Gibco™) и 2 mM Gluta-Max I. Для трансфекции использовали кит Nucleofector™ I/II/2b (Lonza), клетки сеяли в 6-луночные панели и инкубировали при 37°C. На следующий день добавляли трипсин до конечной концентрации для заражения 10-дневных куриных эмбрионов и культивировали двое суток при температуре 34°C. Генетическую стабильность FluCoV-N проверяли путем 10 последовательных пассажей в куриных эмбрионах с последующим контролем вставки методом ПЦР. Для этого вирусную РНК изолировали с помощью QIAamp Viral RNA Mini Kit согласно инструкции производителя с последующей обратной транскрипцией и амплификацией методом ПЦР. Для ПЦР использовали кит QIAGEN® OneStep RT-PCR. Для контроля присутствия трансгена использовали праймеры F-NS-372: 5´-GTATCAGAATGGACCAGG и Len R: 5’-CTCTTGTTCCACTTCAAAT, контроль амплификации проводили методом электрофореза в агарозном геле. Контрольный вирус Flu-NS124, не содержащий вставки трансгена, был получен аналогичным методом.

Иммунофлуоресценция

Проверку функциональной активности белка вставки определяли в реакции иммунофлуоресценции с окраской специфическими антителами. Для этого свежий монослой клеток А549 в 24-луночных планшетах инфицировали вектором FluCoV-N с множественностью заражения 2. Клетки инкубировали при 34°C в течение 24 ч, пермеабилизировали Triton Х100 и фиксировали 4%-м параформальдегидом в течение 20 мин. Далее клетки обрабатывали 1% раствором бычьего сывороточного альбумина (bovine serum albumin, BSA) в течение ночи. Специфические к N белку SARS-CoV-2 антитела (2019-nCoV, Nucleocapsid Antibody, Rabbit PAb, Antigen Affinity Purified, SinoBiological, Cat: 40588-T62) разводили 1:200 в блокирующем растворе и добавляли к клеткам на 2 часа. Связывание первичных антител визуализировали с использованием антикроличьих антител, меченных AlexaFluor 488 FITC (Thermo Fisher), после 30 мин инкубации.

Культивирование вектора в развивающихся куриных эмбрионах

Свободные от патогенов эмбрионы получали от VALIO Biomedia (Германия). Вирус культивировали в 10-дневных эмбрионах при 34°C в течение 48 ч. Репродукцию вируса определяли по наличию гемагглютинирующей активности с куриными эритроцитами. Далее вирус очищали от аллантоиса и концентрировали c помощью тангенциальной фильтрации в буфере, содержащем сахарозу, разливали по пробиркам и замораживали. Титр вируса составил 9.4 log₁₀ ЭИД₅₀/мл.

Определение уровня IFNα в репортерных клетках HEK-Blue™ IFNα/β

Клетки HEK-Blue™ IFNα/β, созданные путем стабильной трансфекции клеток HEK293 генами человека STAT2 и IRF9 для получения активного сигнального пути IFN I, позволяют обнаруживать биологически активные IFN I типа человека путем мониторинга активации пути ISGF3. Клетки дополнительно трансфицировали геном SEAP под контролем индуцируемого IFNα/β промотора ISG54. Стимуляция клеток HEK-Blue™ IFNα/β человеческим IFNα или IFNβ активирует путь JAK/STAT/ISGF3 и впоследствии индуцирует выработку SEAP. Уровни SEAP в супернатанте определяли с помощью QUANTI-Blue™ (http://www.invivogen.com/hek-blue-ifn-ab). Репортерную клеточную линию поддерживали и культивировали в среде MEM Дульбекко в присутствии 10% FCS и 30 мкг/мл бластицидина (100 мкг/мл, Zeocin™) и пассировали до достижения 70-80%-ного монослоя. Клетки А549 инфицировали вирусами при множественности инфекции 2. Через 24 ч после заражения супернатанты отбирали и измеряли наличие IFNα в репортерных клеточных линиях.

Протективная эффективность вектора FluCoV-N против гетерологичного вируса гриппа на хорьках

Исследование на хорьках было выполнено в компании VOXCAN (Франция). Свободные от патогенов (specific pathogen free, SPF) хорьки (mustela putorius furo), самцы, в возрасте 11 недель, были получены из Marshall Bioresources (США). Животных чипировали и проверяли на содержание антител к актуальным вирусам гриппа A/Noway/16606/2021(H3N2), A/Victoria/1/2020 (H1N1), B/Austria/1359417/2021 и B/Phuket /3073/2013. Содержали животных в специальных клетках для хорьков в помещении 2-го уровня биобезопасности (biosafety level 2, BSL2) до инфицирования и BSL3 после заражения. В помещении поддерживали температуру 18°C и световой режим 12/12 ч. Животных обеспечивали кормом для хорьков и водой ad libitum.

На день -25 исследования животных делили на группы по 6 особей в каждой и иммунизировали под легким наркозом (изофлуран) i.n. вирусом FluCoV-N в объеме 1 мл (9.4 log₁₀ЭИД₅₀/животное). Животные контрольной группы получали PBS. Два животных служили отрицательным контролем. Через 25 дней (день 0) животных заражали эпидемическим вирусом гриппа A/Austria/1516645/2022 (H3N2) в объеме 0.5 мл в дозе 5×10⁴ ТЦИД₅₀/животное (ТЦИД — 50%-я тканевая цитопатическая инфекционная доза). После заражения у животных оценивали клинические симптомы, включающие активность (1-3 балла), чихание (1-2 балла), выделения из носа (1-2 балла), выделения из глаз (1-2 балла), затрудненное дыхание (1-3 балла), состояние слизистых поверхностей, температуру (1-3 балла) и вес. В день -1 у животных брали кровь, а в дни -20, -18, -16, 2, 4 и 6 собирали носовые смывы для проверки наличия вируса. Титрование носовых смывов осуществляли на клетках Vero и титр выражали в ТЦИД₅₀, как описано ранее [30]. На день 6 исследования животных взвешивали, подвергали эвтаназии и собирали легкие и селезенку для макроскопического контроля и выявления вируса в гомогенатах.

Протективная эффективность против SARS-CoV-2 на хомяках

В опытах были использованы сирийские золотистые хомяки (самки и самцы в равной пропорции), из одной партии, весом 50-60 г, полученные из питомника Пущино Московской области. Исследование проводили в Отделе вирусологии НИИ вакцин и сывороток имени И. И. Мечникова (Москва). Всех животных перед началом испытаний осматривали, исключали животных с внешними признаками недомогания (нарушение координации, вялость, снижение аппетита). При формировании экспериментальных групп каждому животному был присвоен индивидуальный номер от 1 до 10 в группах. Рандомизацию животных проводили по массе. Животных содержали в соответствии с правилами Европейской конвенции по защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и иных научных целей (Страсбург, 1986) и правилами по устройству, оборудованию и содержанию экспериментально-биологических клиник (вивариев) (ГОСТ 33215-2014 «Руководство по содержанию и уходу за лабораторными животными»). В помещении поддерживали температуру окружающего воздуха 20-24°C, световой режим 12/12 ч, относительную влажность 45-65%, вентилирование без рециркуляции со сменой воздуха 7-12 объемов комнаты в час.

В эксперименте было 3 группы животных, иммунизированных вектором FluCoV-N, вектором, не содержащим вставки, Flu-NS124 и PBS. Вакцинирование обоими векторами проводили i.n. под легким наркозом в объеме 100 мкл в эквивалентной дозе 8.2 log₁₀ ЭИД₅₀/животное. Животным контрольной группы вводили PBS. На 21-й день после вакцинации животных заражали i.n. под легким наркозом вирусом SARS-CoV-2 в дозе 100 ТЦИД₅₀ на животное, в объеме 50 мкл. После вакцинации и на протяжении всего опыта животных осматривали, отмечая клинические признаки, включая общее состояние, интерес к воде и пище и активность животных. На 2-й и 5-й дни после заражения вирусом SARS-CoV-2 забивали половину животных, собирали легкие. Для анализа патологии в легких готовили гистологические срезы легких, которые окрашивали HE&E. Органы для титрования вируса гомогенизировали, центрифугировали, надосадочную жидкость разливали по аликвотам и замораживали.

Для определения инфекционного титра вируса в легких хомяков клетки Vero CCL81 сеяли в 96-луночные планшеты (Costar) со средней плотностью 20000 клеток на лунку и выращивали в среде МЕМ в присутствии 5% FCS, 10 мМ глутамина и антибиотиков (пенициллин 100 МЕ/мл и стрептомицин 100 мкг/мл) в течение 3 дней до формирования полного монослоя. Перед заражением вирусом культуру клеток дважды промывали средой DMEM без сыворотки. Готовили 10-кратные разведения каждой пробы легких. Приготовленные разведения в объеме 200 мкл вносили в планшеты с культурой клеток и инкубировали при 37°C и 5% CO₂ в течение 5 дней до появления цитопатического эффекта в клетках вирусного контроля. Учет проводили с использованием количественного теста МТТ. Титр вируса выражали в lоg₁₀ТЦИД₅₀/мл.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Структура и свойства рекомбинантного вектора FluCoV-N

Вектор FluCoV-N был сконструирован на основе штамма вируса гриппа PR/8/34 (H1N1), в котором для обеспечения аттенуации и иммуногенности вируса, белок NS1 был укорочен до 124 аа [33] (Рис. 1А). Дополнительно, ген, кодирующий NEP белок вируса PR/8/34, был заменен на соответствующий ген вируса другого подтипа A/Singapore/1/57 (H2N2), отличающийся 6 аминокислотными заменами. Данные модификации привели к появлению ts фенотипа, т. е. неспособности вируса к эффективной репродукции при 39℃ (Рис. 1Б) и высокой интерфероногенности по сравнению с контрольным штаммом дикого типа PR/8/34 (Рис. 1В). В качестве трансгена, в продолжение рамки считывания белка NS1 был встроен N-концевой участок гена белка N коронавируса SARS-CoV-2 длиной 209 аминокислотных остатков. Наличие экспрессии трансгена определяли с помощью иммунофлуоресценции используя специфические антитела к белку N (Рис. 1Г, Д). Интересно, что химерный белок NS_1-124-N_1-209 выявлялся в основном в цитоплазме зараженных клеток, хотя белок NS1 и ранее полученные его химерные конструкции имели более выраженную ядерную локализацию [34].

Рис. 1.

Структура и характеристика вектора FluCoV-N. А. Схематическое изображение структуры рекомбинантного ns сегмента FluCoV-N; Б. Репродукция вектора FluCoV-N и вируса PR/8/34 в куриных эмбрионах при температурах 34°C и 39°C. Данные представлены как среднее трех опытов (Mean±SD); В. Индукция IFN I типа вирусами FluCoV-N и PR/8/34 в клетках A549, которую оценивали в клеточном супернатанте через 24 ч после заражения путем стимуляции репортерных клеток HEK-Blue™ IFN-α/β. Данные представлены как среднее OD₆₂₀ трех лунок (Mean±SD); Г, Д. Специфическая окраска интактных клеток Vero (Г) или инфицированных вектором FluCoV-N клеток (Д) aнтителами к N белку вируса SARS-CoV-2. (****) означает достоверную разницу между соответствующими значениями согласно t-критерию Стьюдента, р<0.0001.

Для осуществления доклинических исследований вектор FluCoV-N накапливали в куриных эмбрионах. Вируссодержащие аллантоисные жидкости очищали с помощью тангенциальной фильтрации с целью концентрации и очистки вируса от овальбумина, как описано в разделе «Материалы и методы». Концентрат содержал 9.4 log₁₀ЭИД₅₀/мл вируса, который разводили до рабочих концентраций непосредственно перед заражением животных.

Защитная эффективность FluCoV-N вектора против гетерологичного штамма вируса гриппа A/Austria/1516645/2022(H3N2) и против коронавируса SARS-CoV-2 была изучена на хорьках и хомяках соответственно.

Защитная эффективность вектора FluCoV-N против вируса гриппа A/Austria/1516645/2022(H3N2) на хорьках

Вакцинный вектор FluCoV-N при i.n. иммунизации хорьков в дозе 9.4 log₁₀ЭИД₅₀ не вызывал изменения веса животных, повышения температуры или появления клинических симптомов. Через 25 дней после однократной иммунизации FluCoV-N вектором животных заражали гетерологичным штаммом вируса гриппа A/Austria/1516645/2022 (H3N2). У иммунизированных животных, в отличие от группы контроля, не отмечали падение веса в период после инфицирования (вечер дня 2, p<0.001). Вес продолжал равномерно повышаться до последнего, 6-го дня наблюдения (Рис. 2). У контрольных животных, иммунизированных PBS, через 2 дня после заражения эпидемическим вирусом A/Austria/1516645/2022 (H3N2) отмечали снижение веса с потерей 3.2±0.8% и 2.2±1.2% на 2-й день утром и вечером соответственно (Рис. 2).

Рис. 2.

Средний вес тела иммунизированных хорьков после заражения гетерологичным эпидемическим вирусом A/Austria/1516645/2022 (H3N2). Опытные группы включали по 6 животных, группа интактных – 2 животных. Данные представлены как среднее от веса в день 0 (в %) шести животных (Mean±SD). Иммунизацию животных осуществляли на день -25. Заражение хорьков эпидемическим вирусом A/Austria/1516645/2022 (H3N2) проводили в день 0. (***) означает достоверную разницу в весе иммунизированных хорьков по сравнению с контрольной группой согласно t-критерию Стьюдента (p<0.001).

Начиная со 2-го дня после заражения, у хорьков контрольной группы (PBS) также отмечали клинические симптомы, проявляющиеся в легких выделениях из носа. Аналогичные выделения были отмечены и у животных, вакцинированных вирусом FluCoV-N, которые пропали к 5-му дню наблюдения. Однако у 3 из 6 животных контрольной группы, иммунизированных PBS, начиная с 5-го дня, отмечали усиление клинических признаков, которые проявлялись в апатичном поведении, треморе, чихании, выделениях из носа и учащенном дыхании (тахипноэ) (Рис. 3). Индекс клинических симптомов в группе хорьков, получившей PBS на 5-й и 6-й дни, составил 2.3±2.9 и 1.8±2.6 соответственно. В группе животных, вакцинированных вирусом FluCoV-N, начиная с 5-го дня клинические проявления пропали (0.0±0.0).

Рис. 3.

Клинические симптомы у животных после заражения вирусом A/Austria/1516645/2022 (H3N2). Опытные группы включали по 6 животных, группа интактных – 2 животных. Симптомы выражали в баллах, данные представлены как Mean±SD.

На день 6 после инфицирования животные были подвергнуты эвтаназии. Определение вирусной нагрузки в легких показало наличие вируса H3N2 у половины контрольных животных (Рис. 4). У этих же животных отмечали усиление клинических симптомов начиная с 5-го дня. В селезенке вирус был обнаружен только у одного из 6 животных и составил 1.59×10³ТЦИД₅₀/мл. В легких и селезенке хорьков, иммунизированных вектором FluCoV-N, вирус выявлен не был.

Рис. 4.

Титры вируса A/Austria/1516645/2022 (H3N2) в легких хорьков на 6-й день после инфицирования. Опытные группы включали по 6 животных, группа интактных – 2 животных. Данные представлены как Mean±SD. Пунктирной линией обозначен предел титрования, равный 1.0 log₁₀ТЦИД₅₀/мл.

Защитная эффективность вектора FluCoV-N против SARS-CoV-2 на хомяках

Хомяков иммунизировали i.n. препаратом FluCoV-N или вектором без вставки трансгена Flu-NS124 в дозе 8.2 log₁₀ЭИД₅₀ в объеме 100 мкл под легким эфирным наркозом. Животные контрольной группы получали PBS. Вакцинация не вызывала у животных симптомов недомогания, слабости, пониженного аппетита или других клинических признаков аллергической или воспалительной природы. После вакцинации животные стабильно набирали вес, случаев гибели выявлено не было. Местных реакций также не наблюдали.

На 21-й день после вакцинации животных заражали i.n. вирусом SARS-CoV-2 (штамм Wuhan) в дозе 100 ТЦИД₅₀ на животное под легким наркозом в объеме 50 мкл. На 2-й и 5-й дни после заражения животных подвергали эвтаназии и собирали легкие и селезенку для определения в них наличия вируса. В контрольной группе невакцинированных животных на 2-й день после инфицирования титр вируса в легких составил 6.45 log₁₀ТЦИД₅₀/0.1 мл, что свидетельствовало об остром развитии инфекции. Иммунизация препаратом FluCoV-N приводила к достоверному снижению титра вируса в легких на 2-й день до 2.25 log₁₀ТЦИД₅₀/0.1 мл (Рис. 5). Иммунизация вектором без вставки трансгена не приводила к достоверному снижению титра коронавируса в легких хомяков, что свидетельствовало об отсутствии эффекта неспецифической защиты, обусловленной введением гриппозного вектора. На 5-й день после контрольного заражения титры вируса в легких всех экспериментальных групп не иммунизированных и иммунизированных обоими векторами животных находились в диапазоне 4.0-4.5 log₁₀ТЦИД₅₀/0.1 мл.

Рис. 5.

Репродукция вируса SARS-CoV-2 в легких хомяков на день 2 и 5 после заражения SARS-CoV-2 (Wuhan). Титры вируса представлены как Mean±SD. Число животных в группах: контроль – 5, FluCoV-N – 4 (один из хомяков был выведен из исследования по причине, не связанной с экспериментом), Flu-NS₁₂₄ – 5. Пунктирной линией обозначен предел титрования, равный 1.5 log₁₀ТЦИД₅₀/0.1 мл. (****) означает достоверную разницу по сравнению с контрольной группой, получавшей PBS вместо вектора, согласно критерию Стьюдента t, р<0.0001.

Таким образом, эффект вакцинации вирусом FluCoV-N проявился в достоверном (p<0.0001) снижении титров коронавируса в легких на 2-й день после контрольного заражения, но на 5-й день титры выравнивались с контрольной группой.

Гистологическое изучение легких сирийских хомяков контрольной группы выявило характерные для инфекции SARS-CoV-2 выраженные альтеративно- воспалительные изменения во всех долях, которые по морфологическим признакам соответствовали вирусной (интерстициальной) пневмонии. Площадь обширных сливных безвоздушных зон пневмонии с прилегающими к ним участками альвеолита составляла у животных от 30 до 60% от общей площади среза доли лёгкого (Рис. 6А, Б).

Рис. 6.

Морфологическая характеристика лёгких хомяков контрольной группы на 5-е сутки после заражения SARS-CoV-2. А, Б — выраженные воспалительные изменения в лёгких, вызванные SARS-CoV-2: безвоздушные очаги интерстициальной пневмонии, расположенные перибронхиально. Окраска HE&E, увеличение 40× (А, Б).

При изучении гистопрепаратов лёгких хомяков, вакцинированных вектором FluCoV-N, отмечали тенденцию к снижению показателей повреждения тканей по сравнению с состоянием легких в контрольной группе по выраженности альтеративных и воспалительных изменений в респираторном и воздухопроводящем отделах лёгких. У двух животных гистологическая картина была существенно лучше, чем в группе контроля. Локусы дистрофически изменённых мерцательных эпителиоцитов в бронхах и бронхиолах встречались редко, повреждение межальвеолярных перегородок и нарушения гемодинамики были менее выражены, чем у животных контрольной группы. В очагах пневмонии отмечено снижение содержания клеток, погибающих путём апоптоза. Степень инфильтрации межальвеолярных перегородок макрофагами и лимфоцитами была умеренной. Диффузный перибронхиальный и периваскулярный лимфоидно-гистиоцитарный инфильтрат был скудным, реже – умеренным (Рис. 7).

Рис. 7.

Морфологическая характеристика лёгких хомяков, вакцинированных вирусом FluCoV-N, на 5-е сутки после заражения SARS-CoV-2. А, Б — умеренно выраженные воспалительные изменения в лёгких, вызванные SARS-CoV-2: небольшие локусы альвеолита в перибронхиальных участках респираторного отдела. Окраска HE&E. Увеличение 40×.

Таким образом, вакцинация сирийских хомяков вектором FluCoV-N приводила к демпфированию репродукции коронавируса в легких на ранних сроках после инфекции, что отражалось в улучшении гистологической картины легких в момент их эвтаназии на 5-й день после инфицирования.

ОБСУЖДЕНИЕ

Проблема эффективности вакцинации против вирусов, подвергающихся постоянным антигенным изменениям в процессе эволюции, в настоящее время решается с помощью мониторинга вирусных изолятов и обновления состава вакцин для обеспечения их соответствия циркулирующим штаммам. Помимо сложности и дороговизны, такая процедура не годится в случае внезапного появления новых вирусов в человеческой популяции, как это недавно случилось с коронавирусом SARS-CoV-2 или вирусами гриппа А, вызывающими пандемии. В связи с этим существует насущная необходимость создания вакцин, которые могли бы служить вакцинами резерва. Такие препараты должны быть основаны на принципе индукции иммунного ответа к консервативным антигенным детерминантам и благодаря этому являться универсальными. Общепризнано, что универсальность вакцины не может быть достигнута только за счет антительного нейтрализующего ответа, поскольку вирусы легко преодолевают этот барьер путем мутаций, ведущих к изменению конформации или гликозилирования поверхностных гликопротеинов [35]. Роль Т-кросс-протективного клеточного ответа в контроле над вирусными респираторными инфекциями была продемонстрирована в опытах на животных [18, 19] и в эпидемиологических наблюдениях на людях [36].

Особое место в составе множественных популяций Т-лимфоцитов занимают резидентные Т_rm клетки, ассоциированные с мукозными поверхностями, в частности, респираторного тракта. Эти клетки, при распознавании консервативного эпитопа патогена во входных воротах инфекции способны к быстрой выработке IFNγ, который стимулирует выработку хемокинов – агонистов CXCR3 рецептора. При этом в первичный очаг инфекции привлекаются различные субпопуляции лимфоцитов, способные к уничтожению зараженных клеток [37]. При малой множественности заражения, как это происходит в естественных условиях, эти лимфоциты способны нейтрализовать инфекцию до широкого распространения вируса в респираторном тракте и реализации им разнообразных иммуносупрессорных механизмов, препятствующих развитию эффективного врожденного и адаптивного иммунитетов [38]. При парентеральной иммунизации формирование Т_rm является проблематичным, что вызывает постоянный поиск вариантов i.n. вакцин для создания кросс-протективного мукозального иммунитета [39].

Другой проблемой современной вакцинологии является необходимость многократных вакцинаций. Так, во время пандемии SARS-CoV-2 вакцины, полученные на основе mRNA или аденовирусного вектора, применялись до 4-5 раз, чтобы сдержать мутирующий вирус [40].

Цель настоящего исследования состояла в создании вакцины против вируса гриппа и коронавируса, пригодной для однократной i.n. иммунизации в чрезвычайных условиях пандемии. Вакцинация такой вакциной должна создавать перекрестную защиту и защитить от вновь появляющегося нового вируса с целью выигрыша времени для создания специфической вакцины, вызывающей нейтрализующий антительный ответ против нового возбудителя. Для достижения этой цели мы сконструировали базовый вектор FluCoV-N на основе штамма PR/8/34 (H1N1). Вакцинный вектор представляет собой рекомбинантный вирус гриппа, в который были введены аттенуирующие изменения в генах ns1 и nep, позволившие создать ts вирус, стимулирующий систему IFN I типа. Уровень безопасности такого вируса позволил вводить животным высокие дозы вакцины, превышающие 8.0 log₁₀ЭИД₅₀, без токсических эффектов или повреждения легких. Базовый вектор был дополнен последовательностью N-терминальной половины белка N вируса SARS-CoV-2, содержащей В-и Т-клеточные эпитопы [41]. Вектор FluCoV-N обладает способностью к росту в куриных эмбрионах до высоких титров и при этом проявляет генетическую стабильность, сохраняя ts и интерфероногенность. Данные иммунофлюоресцентного анализа подтвердили высокую интенсивность накопления N антигена коронавируса в цитоплазме зараженных клеток. Среди белков коронавируса, способных вызывать перекрестно-реактивные ответы, белок N представляет повышенный интерес как один из наиболее обильных белков, образующихся в ходе репликации вируса, и имеющий высокую степень гомологии среди коронавирусов [42]. Показано, что белок N является важной мишенью специфичных для SARS-CoV-2 ответов Т-клеток во время COVID-19. При этом N-специфичные CD8+ Т-клетки SARS-CoV-2 связаны с защитой оттяжелого заболевания, контролем репликации вируса и сохранением противовирусной эффективности против нескольких вариантов вируса (Альфа, Бета, Гамма и Дельта) по крайней мере через 6 месяцев после заражения [43]. Следовательно, иммунный ответ против N белка может защитить от заболевания различными штаммами SARS-CoV-2.

При изучении профилактической эффективности против гриппа и SARS-CoV-2 мы преследовали цель индукции протективного иммунного ответа уже после однократной i.n. иммунизации. С этой целью использовали максимальную дозу вирусного вектора для каждого вида животных. Для моделирования защиты от гриппа использовали хорьков, зараженных современным штаммом вируса гриппа A/Austria/1516645/2022 (H3N2), эволюционно удаленным от вакцинного вируса H1N1 подтипа. После челленджа хорьки продемонстрировали способность к быстрому разрешению инфекции, в то время как у половины животных контрольной группы усиливались клинические симптомы гриппа на протяжении 6 дней до дня эвтаназии. Более того, только в контрольной группе наблюдалось выделение вируса из легочной ткани. Следует отметить, что инфекция вирусом H3N2 была весьма умеренной и не вызывала лихорадочных реакций у хорьков. Обнаруженный защитный эффект в отношении гетерологичного штамма следует в будущем подтвердить c использованием более вирулентного вируса гриппа – например, высокопатогенного штамма птичьего гриппа.

Наибольший интерес представляло наличие защитного эффекта от вакцинации вектором при инфекции SARS-CoV-2 у хомяков. Полученные результаты позволяют сделать вывод, что иммунизация хомяков высокой дозой (8.2 log₁₀ЭИД₅₀) вектора также не вызывала существенных клинических проявлений гриппозной инфекции у этих животных. В отличии от модели гриппозной инфекции у хорьков заражение хомяков SARS-CoV-2 сопровождалось чрезвычайно высокой вирусной нагрузкой в легких через 2 дня после заражения. Удивительно, но однократная вакцинация гриппозным вектором смогла снизить титры вируса в гомогенатах легкого примерно в 10000 раз на второй день после контрольного заражения. Гистологические исследования на 5-й день после контрольного заражения выявили тенденцию к улучшению состояния легочной ткани по сравнению с контрольной группой. Вместе с тем следует отметить, что вирусные титры в легких зараженных хомяков выровнялись между контрольной и вакцинированной группой на 5-й день после заражения, составляя примерно 4.0 log₁₀ТЦИД₅₀/0.1 мл. Таким образом, в отличие от модели гриппозной инфекции у хорьков, эффект вакцинации, с точки зрения вирусной нагрузки, терялся с течением времени у хомяков, зараженных коронавирусом. Данный феномен может быть объяснен наличием у коронавируса целого набора неструктурных белков, способных подавлять цитотоксическую активность лимфоцитов [44]. Обнаруженный эффект требует дальнейших исследований и усилий по оптимизации данного вектора за счет включения протективных эпитопов ранних белков. Возможной альтернативой может быть использование мукозальных адъювантов для усиления формирования иммунитета, ассоциированного с респираторным трактом.

Наше исследование показало, что получение параллельного защитного эффекта от гриппа и SARS-CoV-2 при однократной i.n. иммунизации высокой дозой высокоаттенуированного гриппозного вектора вполне достижимо. Векторы, аналогичные FluCoV-N, имеют хорошие перспективы с точки зрения продолжения клинических исследований.

Финансирование:

Работа была выполнена на средства ООО ФАРМ БИОТЕХ и ООО Каприкорн Биотех.

Конфликт интересов:

Авторы подтверждают отсутствие конфликта интересов.

CПИСОК ИСТОЧНИКОВ

1. Blumenthal KG, Greenhawt M, Phillips EJ, Agmon-Levin N, Golden DBK, Shaker M. An Update in COVID-19 Vaccine Reactions in 2023: Progress and Understanding. J Allergy Clin Immunol Pract 2023; 11(11), 3305-18. https://doi.org/10.1016/j.jaip.2023.06.057.

2. Zhou Z, Zhu Y, Chu M. Role of COVID-19 Vaccines in SARS-CoV-2 Variants. Front Immunol 2022; 13, 898192. https://doi.org/10.3389/fimmu.2022.898192.

3. Hornsby H, Nicols AR, Longet S, Liu C, Tomic A, Angyal A, et al. Omicron infection following vaccination enhances a broad spectrum of immune responses dependent on infection history. Nat Commun 2023; 14(1), 5065. https://doi.org/10.1038/s41467-023-40592-4.

4. Luo CH, Morris CP, Sachithanandham J, Amadi A, Gaston D, Li M, et al. Infection with the SARS-CoV-2 Delta Variant is Associated with Higher Infectious Virus Loads Compared to the Alpha Variant in both Unvaccinated and Vaccinated Individuals. medRxiv 2021. https://doi.org/10.1101/2021.08.15.21262077.

5. Feng L, Feng S, Chen T, Yang J, Lau YC, Peng Z, et al. Burden of influenza-associated outpatient influenza-like illness consultations in China, 2006-2015: A population-based study. Influenza Other Respir Viruses 2020; 14(2), 162-72. https://doi.org/10.1111/irv.12711.

6. Monto AS, Koopman JS, Longini IM, Jr. Tecumseh study of illness. XIII. Influenza infection and disease, 1976-1981. Am J Epidemiol 1985; 121(6), 811-22. https://doi.org/10.1093/oxfordjournals.aje.a114052.

7. Bosaeed M, Kumar D. Seasonal influenza vaccine in immunocompromised persons. Hum Vaccin Immunother 2018; 14(6), 1311-22. https://doi.org/10.1080/21645515.2018.1445446.

8. Turner PJ, Fleming L, Saglani S, Southern J, Andrews NJ, Miller E, et al. Safety of live attenuated influenza vaccine (LAIV) in children with moderate to severe asthma. J Allergy Clin Immunol 2020; 145(4), 1157-64 e6. https://doi.org/10.1016/j.jaci.2019.12.010.

9. Rudenko L, Yeolekar L, Kiseleva I, Isakova- Sivak I. Development and approval of live attenuated influenza vaccines based on Russian master donor viruses: Process challenges and success stories. Vaccine 2016; 34(45), 5436-41. https://doi.org/10.1016/j.vaccine.2016.08.018.

10. Wang WC, Sayedahmed EE, Sambhara S, Mittal SK. Progress towards the Development of a Universal Influenza Vaccine. Viruses 2022; 14(8). https://doi.org/10.3390/v14081684.

11. Poehling KA, Caspard H, Peters TR, Belongia EA, Congeni B, Gaglani M, et al. 2015-2016 Vaccine Effectiveness of Live Attenuated and Inactivated Influenza Vaccines in Children in the United States. Clin Infect Dis 2018; 66(5), 665-72. https://doi.org/10.1093/cid/cix869.

12. Mohn KG, Brokstad KA, Islam S, Oftung F, Tondel C, Aarstad HJ, et al. Early Induction of Cross-Reactive CD8+ T-Cell Responses in Tonsils After Live-Attenuated Influenza Vaccination in Children. J Infect Dis 2020; 221(9), 1528-37. https://doi.org/10.1093/infdis/jiz583.

13. He XS, Holmes TH, Zhang C, Mahmood K, Kemble GW, Lewis DB, et al. Cellular immune responses in children and adults receiving inactivated or live attenuated influenza vaccines. J Virol 2006; 80(23), 11756-66. https://doi.org/10.1128/JVI.01460-06.

14. Sun W, Luo T, Liu W, Li J. Progress in the Development of Universal Influenza Vaccines. Viruses 2020; 12(9). https://doi.org/10.3390/v12091033.

15. Ferko B, Katinger D, Grassauer A, Egorov A, Romanova J, Niebler B, et al. Chimeric influenza virus replicating predominantly in the murine upper respiratory tract induces local immune responses against human immunodeficiency virus type 1 in the genital tract. J Infect Dis 1998; 178(5), 1359-68. https://doi.org/10.1086/314445.

16. Sereinig S, Stukova M, Zabolotnyh N, Ferko B, Kittel C, Romanova J, et al. Influenza virus NS vectors expressing the mycobacterium tuberculosis ESAT-6 protein induce CD4+ Th1 immune response and protect animals against tuberculosis challenge. Clin Vaccine Immunol 2006; 13(8), 898-904. https://doi.org/10.1128/CVI.00056-06.

17. Stukova MA, Sereinig S, Zabolotnyh NV, Ferko B, Kittel C, Romanova J, et al. Vaccine potential of influenza vectors expressing Mycobacterium tuberculosis ESAT-6 protein. Tuberculosis (Edinb) 2006; 86(3-4), 236-46. https://doi.org/10.1016/j.tube.2006.01.010.

18. Vasilyev KA, Yukhneva MA, Shurygina AP, Stukova MA, Egorov AY. Enhancement of the immunogenicity of influenza A virus by the inhibition of immunosuppressive function of NS1 protein. MIR Journal 2018; 5(1), 48-58. https://doi.org/10.18527/2500-2236-2018-5-1-48-58.

19. Vasilyev KA, Shurygina AP, Stukova MA, Egorov AY. Enhanced CD8+ T-cell response in mice immunized with NS1-truncated influenza virus. MIR Journal 2020; 7(1), 24-33. https://doi.org/10.18527/2500-2236-2020-7-1-24-33.

20. Vincent AL, Ma W, Lager KM, Janke BH, Webby RJ, Garcia-Sastre A, et al. Efficacy of intranasal administration of a truncated NS1 modified live influenza virus vaccine in swine.Vaccine 2007; 25(47), 7999-8009. https://doi.org/10.1016/j.vaccine.2007.09.019.

21. Hai R, Martinez-Sobrido L, Fraser KA, Ayllon J, Garcia-Sastre A, Palese P. Influenza B virus NS1-truncated mutants: live-attenuated vaccine approach. J Virol 2008; 82(21), 10580-90. https://doi.org/10.1128/JVI.01213-08.

22. Wressnigg N, Shurygina AP, Wolff T, Redlberger-Fritz M, Popow-Kraupp T, Muster T, et al. Influenza B mutant viruses with truncated NS1 proteins grow efficiently in Vero cells and are immunogenic in mice. J Gen Virol 2009; 90(2), 366-74. https://doi.org/10.1099/vir.0.006122-0.

23. Romanova J, Krenn BM, Wolschek M, Ferko B, Romanovskaja-Romanko E, Morokutti A, et al. Preclinical evaluation of a replication-deficient intranasal DeltaNS1 H5N1 influenza vaccine. PLoS One 2009; 4(6), e5984. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0005984.

24. Steel J, Lowen AC, Pena L, Angel M, Solorzano A, Albrecht R, et al. Live attenuated influenza viruses containing NS1 truncations as vaccine candidates against H5N1 highly pathogenic avian influenza. J Virol 2009; 83(4), 1742-53. https://doi.org/10.1128/JVI.01920-08.

25. Wang P, Zheng M, Lau SY, Chen P, Mok BW, Liu S, et al. Generation of DelNS1 Influenza Viruses: a Strategy for Optimizing Live Attenuated Influenza Vaccines. mBio 2019; 10(5), e02180-19. https://doi.org/10.1128/mBio.02180-19.

26. Zhou R, Wang P, Wong YC, Xu H, Lau SY, Liu L, et al. Nasal prevention of SARS-CoV-2 infection by intranasal influenza-based boost vaccination in mouse models. EBioMedicine 2022; 75, 103762. https://doi.org/10.1016/j.ebiom.2021.103762.

27. Zhu F, Zhuang C, Chu K, Zhang L, Zhao H, Huang S, et al. Safety and immunogenicity of a live-attenuated influenza virus vector-based intranasal SARS-CoV-2 vaccine in adults: randomised, double-blind, placebo-controlled, phase 1 and 2 trials. Lancet Respir Med 2022; 10(8), 749-60. https://doi.org/10.1016/S2213-2600(22)00131-X.

28. Ghendon YZ, Polezhaev FI, Lisovskaya KV, Medvedeva TE, Alexandrova GI, Klimov AI. Recombinant cold-adapted attenuated influenza A vaccines for use in children: molecular genetic analysis of the cold-adapted donor and recombinants. Infect Immun 1984; 44(3), 730-3. https://doi.org/10.1128/iai.44.3.730-733.1984.

29. Stasakova J, Ferko B, Kittel C, Sereinig S, Romanova J, Katinger H, et al. Influenza A mutant viruses with altered NS1 protein function provoke caspase-1 activation in primary human macrophages, resulting in fast apoptosis and release of high levels of interleukins 1beta and 18. J Gen Virol 2005; 86(1), 185-95. https://doi.org/10.1099/vir.0.80422-0.

30. Romanova J, Katinger D, Ferko B, Voglauer R, Mochalova L, Bovin N, et al. Distinct host range of influenza H3N2 virus isolates in Vero and MDCK cells is determined by cell specific glycosylation pattern. Virology 2003; 307(1), 90-7. https://doi.org/10.1016/S0042-6822(02)00064-8.

31. Lee CW. Reverse genetics of influenza virus. Methods Mol Biol 2014; 1161, 37-50. https://doi.org/10.1007/978-1-4939-0758-8_4.

32. Perez DR, Seibert B, Ferreri L, Lee CW, Rajao D. Plasmid-Based Reverse Genetics of Influenza A Virus. Methods Mol Biol 2020; 2123, 37-59. https://doi.org/10.1007/978-1-0716-0346-8_4.

33. Egorov A, Brandt S, Sereinig S, Romanova J, Ferko B, Katinger D, et al. Transfectant influenza A viruses with long deletions in the NS1 protein grow efficiently in Vero cells. J Virol 1998; 72(8), 6437-41. https://doi.org/10.1128/jvi.72.8.6437-6441.1998.

34. Pulkina A, Vasilyev K, Muzhikyan A, Sergeeva M, Romanovskaya-Romanko E, Shurygina AP, et al. IgGkappa Signal Peptide Enhances the Efficacy of an Influenza Vector Vaccine against Respiratory Syncytial Virus Infection in Mice. Int J Mol Sci 2023; 24(14), 11445. https://doi.org/10.3390/ijms241411445.

35. Fiolet T, Kherabi Y, MacDonald CJ, Ghosn J, Peiffer-Smadja N. Comparing COVID-19 vaccines for their characteristics, efficacy and effectiveness against SARS-CoV-2 and variants of concern: a narrative review. Clin Microbiol Infect 2022; 28(2), 202-21. https://doi.org/10.1016/j.cmi.2021.10.005.

36. Swadling L, Diniz MO, Schmidt NM, Amin OE, Chandran A, Shaw E, et al. Pre-existing polymerase-specific T cells expand in abortive seronegative SARS-CoV-2. Nature 2022; 601(7891), 110-7. https://doi.org/10.1038/s41586-021-04186-8.

37. Chaplin DD. Overview of the immune response. J Allergy Clin Immunol. 2010;125(2, Suppl 2), S3-23. https://doi.org/10.1016/j.jaci.2009.12.980.

38. Newton AH, Cardani A, Braciale TJ. The host immune response in respiratory virus infection: balancing virus clearance and immunopathology. Semin Immunopathol 2016; 38(4), 471-82. https://doi.org/10.1007/s00281-016-0558-0.

39. Zheng MZM, Wakim LM. Tissue resident memory T cells in the respiratory tract. Mucosal Immunol 2022; 15(3), 379-88. https://doi.org/10.1038/s41385-021-00461-z.

40. Larkin HD. Four Vaccine Doses Prevented Severe Omicron COVID-19 Better Than 3. JAMA 2022; 327(18), 1748. https://doi.org/10.1001/jama.2022.7248.

41. Pacheco-Olvera DL, Saint Remy-Hernandez S, Garcia-Valeriano MG, Rivera-Hernandez T, Lopez-Macias C. Bioinformatic Analysis of B- and T-cell Epitopes from SARS-CoV-2 Structural Proteins and their Potential Cross-reactivity with Emerging Variants and other Human Coronaviruses. Arch Med Res 2022; 53(7), 694-710. https://doi.org/10.1016/j.arcmed.2022.10.007.

42. Song W, Fang Z, Ma F, Li J, Huang Z, Zhang Y, et al. The role of SARS-CoV-2 N protein in diagnosis and vaccination in the context of emerging variants: present status and prospects. Front Microbiol 2023; 14, 1217567. https://doi.org/10.3389/fmicb.2023.1217567.

43. Le Bert N, Tan AT, Kunasegaran K, Tham CYL, Hafezi M, Chia A, et al. SARS-CoV-2-specific T cell immunity in cases of COVID-19 and SARS, and uninfected controls. Nature 2020; 584(7821), 457-62. https://doi.org/10.1038/s41586-020-2550-z.

44. Mistry P, Barmania F, Mellet J, Peta K, Strydom A, Viljoen IM, et al. SARS-CoV-2 Variants, Vaccines, and Host Immunity. Front Immunol 2021; 12, 809244. https://doi.org/10.3389/fimmu.2021.809244.